Анотація до роботи:

Куцяба В.І. Взаємодія регуляторних генів біосинтезу рибофлавіну і конструювання штамів-надсинтетиків цього вітаміну у дріжджів Pichia guilliermondii. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.07 – мікробіологія. – Інститут біології клітини НАН України, Львів, 2007.

Дисертація присвячена дослідженню взаємодії регуляторних генів біосинтезу рибофлавіну (РФ) і конструюванню штамів-надсинтетиків цього вітаміну у дріжджів Pichia guilliermondii. Встановлено, що мутації rib80-22, rib83-6 – рецесивні, ядерні і моногенні. Вони викликають порушення регуляції як біосинтезу РФ, так і асиміляції заліза. Регуляторні гени RIB80 і RIB81 та RIB81 і HIT1 взаємодіють між собою за синергідним типом. Суміщення в одному гаплоїдному геномі мутацій rib80-22 і rib81-131 та rib81-131 і hit1-1 веде до зростання продуктивності флавіногенезу у 2-3,5 раза. Мутація rib83-6 блокує надсинтез РФ і дерепресію синтезу фементів флавіногенезу у мутантів rib80, rib81 і у подвійних мутантів rib80 rib81, тобто вона епістатує над мутаціями rib80-22 і rib81-131. Створено систему для клонування регуляторного гена RIB83 позитивного типу дії з використанням як реципієнта сконструйованого потрійного мутанта rib1-86 rib81 rib83. Введенням у геном мутанта генотипу rib80 rib81 мутацій резистентності до аналогів пуринів 8-азагуаніну і 4-амінопіразол[3,4-d]піримідину отримано штами, які синтезують 1,7 г РФ в 1 л синтетичного середовища за 6-7 діб вирощування у лабораторному ферментері. Показано позитивний вплив препарату кормового РФ, отриманого за допомогою одного із селекціонованих штамів, на приріст маси і вагу яєць курей. Таким чином, селекціоновані штами-надсинтетики РФ можуть бути використані для виробництва кормових дріжджів, збагачених вітаміном В₂.

У дисертаційній роботі проведено генетичне та біохімічне дослідження мутантів P. guilliermondii з пошкодженою регуляцією біосинтезу рибофлавіну, зокрема, взаємодії мутантних алелів регуляторних генів при їх суміщенні в одному гаплоїдному геномі та впливу мутацій резистентності до аналогів пуринів на продуктивність флавіногенезу мутантів з пошкодженими регуляторними генами негативного типу дії. Основні наукові та практичні результати роботи викладено у наступних висновках:

1. Генетичний аналіз мутації rib80-22 дріжджів P. guilliermondii показав, що вона є моногенною, ядерною і рецесивною, викликає зростання продуктивності біосинтезу рибофлавіну у 20 – 30 разів, швидкості транспорту заліза у 4 – 10 разів, вмісту заліза у клітинах в 1,5 – 2 рази при вирощуванні у середовищі з оптимальним для росту вмістом заліза. Таким чином, ген RIB80 бере участь у регуляції як біосинтезу рибофлавіну, так і асиміляції заліза.

2. Показано, що регуляторні гени RIB80 і RIB81та RIB81 і HIT1 взаємодіють між собою за синергідним типом. Суміщення в одному гаплоїдному геномі мутацій rib80-22 і rib81-131 веде до зростання продуктивності флавіногенезу у 2 рази, активності ГТФ-циклогідролази ІІ – 3 рази, швидкості транспорту заліза – 10 разів, але не викликає зростання вмісту заліза у клітинах мутантів rib80 rib81. Гаплоїдні сегреганти генотипу rib81 hit1 за продуктивністю флавіногенезу перевищують штами rib81 у 3 – 3,5 раза. Однак вони нагромаджують невелику біомасу (до 1 мг/мл) і швидко ревертують за ознаками „нагромадження біомаси” і „надсинтез рибофлавіну” до рівня мутантів rib81.

3. Мутація rib83-6 успадковується за моногенним типом, має ядерну локалізацію і є рецесивною. Вона блокує надсинтез рибофлавіну не тільки у мутантів rib80 і rib81, але і у подвійних мутантів rib80 rib81 навіть у залізодефіцитному середовищі, а також знижує швидкість поглинання заліза клітинами, їх фериредуктазну активність і приводить до того, що за умов дефіциту заліза у середовищі мутанти rib83 не ростуть. Отже, ген RIB83 здійснює позитивний контроль як біосинтезу рибофлавіну, так і транспорту заліза та епістатує над генами негативного контролю RIB80 та RIB81.

4. Створено систему для клонування регуляторного гена RIB83 методом функціональної комплементації з використанням як реципієнта сконструйованого потрійного мутанта rib1-86 rib81 rib83. З банку генів P. guilliermondii відібрано рекомбінантну плазміду, яка комплементує або супресує мутацію rib83-6.

5. Суміщення в одному гаплоїдному геномі мутацій rib81 і резистентності до аналога аденіну 4-амінопіразол[3,4-d]піримідину, яка викликає надсинтез пуринів, призводить до зростання продуктивності флавіногенезу мутантів rib81 у 3 – 3,5 раза. Введенням у геном мутанта генотипу rib80 rib81 мутацій резистентності до аналогів пуринів 8-азагуаніну і 4-амінопіразол[3,4-d]піримідину отримано штами, які синтезують 1,7 г рибофлавіну в 1 л синтетичного середовища при вирощуванні у лабораторному ферментері.

6. Додавання препарату кормового рибофлавіну, виготовленого з використанням сконструйованого штама-надсинтетика Agu^r-125 App^r-3, до раціону курей позитивно впливає на приріст маси птиці і вагу яєць. Штам Agu^r-125 App^r-3 може бути використаний для створення промислових штамів-надсинтетиків рибофлавіну і технології виробництва кормових дріжджів, збагачених вітаміном В₂, на середовищах, що містять дешеві відходи харчової промисловості (післяспиртову зернову барду, меласу).

Публікації автора:

1. Сибирный А.А., Шавловский Г.М., Кшановская Б.В., Куцяба В.И. Внутривидовая и межвидовая гибридизация дрожжей путем слияния протопластов. // Сб. «Молекулярная биология». - 1982. - Вып.32. - С. 16-24.

(Дисертантові належить опрацювання робочих схем експериментів, участь у написанні та оформленні статті.)

2. Шавловский Г.М., Федорович Д.В., Куцяба В.И., Бабяк Л.Я., Стенчук Н.Н. Участие гена RIB80 в регуляции биосинтеза рибофлавина и транспорта железа у Pichia guilliermondii. // Генетика. - 1992. - Т.28, №9. - С. 25-32.

(Дисертантові належить опрацювання робочих схем експериментів, аналіз даних літератури і власних результатів, участь у написанні та оформленні статті. Він особисто отримав генетичні докази плейотропності гена RIB80.)

3. Шавловський Г.М., Стенчук М.М., Федорович Д.В., Куцяба В.І. Про взаємодію факторів негативного контролю біосинтезу рибофлавіну у дріжджів Pichia guilliermondii. // Доповіді АН України. - 1994, №10. - С. 138-140.

(Дисертантові належить майже весь експериментальний матеріал статті. Ним особисто сплановано експеримент, в якому показано, що гени RIB80 і RIB81 взаємодіють за типом синергізму.)

4. Шавловский Г.М., Стенчук Н.Н., Куцяба В.И., Федорович Д.В. Совместное влияние мутаций rib80, rib81 и резистентности к 8-азагуанину на биосинтез рибофлавина у Pichia guilliermondii. // Прикл. биохим. и микробиол. - 1997. – Т.33, №1. - С. 61-65.

(Дисертантові належить опрацювання робочих схем експериментів, аналіз даних літератури і власних результатів, участь у написанні та оформленні статті. Майже весь експериментальний матеріал статті отримано за його участі.)

5. Стенчук Н.Н., Куцяба В.И., Кшановская Б.В., Федорович Д.В. Влияние мутации rib83 на биосинтез рибофлавина и ассимиляцию железа у дрожжей Pichia guilliermondii. // Микробиология. –2001. – Т.70, №6. – С. 753-758.

(Дисертант брав участь в опрацюванні робочих схем експериментів, аналізі даних літератури і власних результатів. Він особисто отримав результати, які дали можливість зробити висновок про поліфункціональність гена RIB83.)

6. Куцяба В.И., Стенчук Н.Н., Федорович Д.В. Усиление сверхсинтеза рибофлавина у дрожжей Pichia guilliermondii с помощъю 4-аминопиразол[3,4-d]пиримидина. // Прикл. биохим. и микробиол. - 2002. - Т.38, №3. - С. 268-272.

(Дисертантові належить весь експериментальний матеріал статті. Ним проведено аналіз даних літератури і власних результатів, виконано основну роботу по написанню та оформленню статті.)

7. Стенчук М.М., Федорович Д.В., Куцяба В.І., Шах Є.С., Стояновська Г.М. Селекція високофлавіногенних штамів дріжджів Pichia guilliermondii з підвищеним вмістом заліза в клітинах та біологічна ефективність їх біомаси. // Науково-технічний бюлетень Інституту біології тварин. - 2001. - Вип. 1-2. - С. 326-331.

(Дисертант узагальнив власні результати та опрацював дані літератури, приймав безпосередню участь у написанні статті. Він виготовив препарат кормового РФ, біологічна ефективність якого перевірялась на курах.)

8. Куцяба В.І., Федорович Д.В., Стенчук М.М., Процайло Є.В., Конюхівський І.В., Тарасюк І.В., Процайло А.І. Вплив препарату кормового вітаміну В₂, отриманого за допомогою високофлавіногенних дріжджів Pichia guilliermondii, на продуктивність і масу яєць курей-несучок породи Izabrown. // Науково-технічний бюлетень Інституту біології тварин. – 2002. - Вип. 4, №1. - С. 84-88.

(Дисертантові належить весь експериментальний матеріал статті. Ним проведено аналіз даних літератури і власних результатів. Він особисто проводив експерименти на пташнику ТзОВ “Еней-Пласт”.)

9. Стенчук М.М., Кшановська Б.В., Куцяба В.І., Шавловський Г.М. Особливості біосинтезу рибофлавіну у мутантів Pichia guilliermondii з пошкодженими генами позитивного і негативного типу регуляції флавіногенезу. // Тези доп. VI Українського біохімічного з’їзду. - Київ. - 1992. - Ч.1. - С. 52.

10. Kutsiaba V.I., Stenchuk M.M. Selection of riboflavin overproducing Pichia guilliermondii strains using purine analogues and hybridization. // Proc. 21^st International specialized symposium on yeasts. - Lviv (Ukraine). - 2001. - P. 25.

11. Куцяба В.І., Стенчук М.М. Про взаємодію регуляторних генів негативного типу дії RIB81 і HIT1 у процесі біосинтезу рибофлавіну дріжджами Pichia guilliermondii. // Тези доп. VIII з’їзду Українського біохімічного товариства. – Чернівці. – 2002. – С. 162.

12. Boretsky Y.R., Kapustiak K.Ye., Stenchuk M.M., Stasyk O.V., Kutsyaba V.I., Sybirny A.A. Interrilationship between riboflavin biosynthesis and iron transport in the yeast Pichia guilliermondii. // Proc. The International Bioiron Society World Congress on Iron Metabolism “Bioiron 2003”. – Bethesda (USA). - 2003. - Р. 312.

13. Boretsky Y., Kapustyak K., Pynyaha Y, Fayura L., Kutsyaba V., Prokopiv T., Protchenko O., Babyak L., Stenchuk M., Fedorovych D., Sibirny A. Identification of regulatory genes and promoter seguences involved in regulation of riboflavin synthesis in the yeast Pichia guilliermondii. // Proc. First (Inaugural) Ukrainian Congress for Cell Biology. – Lviv (Ukraine). – 2004. - P. 369.

14. Бабяк Л.Я., Капустяк К.Є., Куцяба В.І, Прокопів Т.М., Протченко О.В., Борецький Ю.Р., Стенчук М.М., Сибірний А.А., Федорович Д.В. Генетичні аспекти регуляції біосинтезу рибофлавіну у дріжджів Pichia guilliermondii. // Тези доп. Х з’їзду Товариства мікробіологів України. - Одеса. - 2004.- - С. 325.

15. Борецький Ю.Р., Пиняга Ю.В., Капустяк К.Є., Куцяба В.І., Борецький В.Ю., Федорович Д.В., Фаюра Л.Р., Сибірний А.А. Біотехнологія мікробного синтезу флавінів. // Матеріали ІХ Українського біохімічного з’їзду. - Харків. – 2006. - Т.2. – С. 140.