Анотація до роботи:

Мороз О.М. Окислювальна конверсія етанолу в ацетальдегід клітинами метилотрофних дріжджів. - Рукопис. - Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.20. - біотехнологія. - Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, Київ, 2003.

Дисертацію присвячено розробці модельної системи процесу біотехнологічного продукування оцтового альдегіду шляхом конверсії екзогенного етанолу в ацетальдегід алкогольоксидазою клітин мутантів метилотрофних дріжджів Hansenula polymorpha. Вивчено вплив мутацій, які блокують активності ферментів метаболізму ацетальдегіду, порушують глюкозну катаболітну репресію синтезу алкогольоксидази, а також приводять до підвищення активності фермента, на ефективність біотрансформації етанолу в оцтовий альдегід клітинами мутантних штамів H. polymorpha. Клітини регуляторного мутанта з підвищеною активністю алкогольоксидази виявилися найбільш ефективними біокаталізаторами процесу. Розроблено новий метод отримання мутантів метилотрофних дріжджів з підвищеною активністю алкогольоксидази. Ізольовано мутант H. polymorpha 7-4А з активністю фермента до 6,8 Од/мг білка після культивування клітин у середовищі з глюкозою. Підібрано умови культивування клітин штаму для отримання високого виходу біомаси. Оптимізовано умови проведення біоконверсії етанолу в ацетальдегід клітинами штаму 7-4А. Показано, що мутації, які приводять до пошкодження етанольної катаболітної інактивації алкогольоксидази, підвищують ефективність біоконверсії етанолу в ацетальдегід клітинами мутантів Pichia methanolica з блоком ацетил-КоА синтетази та ізоцитратліази. Розроблено схему біоконверсії етанолу в ацетальдегід клітинами штаму 7-4А (після спеціальної обробки), у яких стабілізації активності алкогольоксидази в інактивуючих умовах (пошкодження селективної автофагії пероксисом) досягнуто завдяки специфічній дії хімічних реагентів. В оптимальних умовах пермеабілізовані дигітоніном клітини в присутності інгібітора вакуолярних протеїназ – фенілметилсульфонілфториду, при 30^о С конвертували 96,4% етанолу в оцтовий альдегід.

У дисертації приведене теоретичне узагальнення і нове вирішення науково-практичної задачі продукування оцтового альдегіду, що виявляється в розробці модельної системи високоефективного біотехнологічного процесу окислювальної конверсії екзогенного етанолу в ацетальдегід алкогольоксидазою клітин регуляторного мутанта H. polymorpha, вирощених у середовищі з глюкозою. Досягнуто майже повного (96,4%) окислення етанолу в оцтовий альдегід (при 30^о С в оптимальних умовах) під час інкубації клітин дріжджів у колбах на круговій качалці (200 об./хв) без додаткового постачання киснем.

1. Виявлено позитивний вплив мутацій, які блокують активності редуктази ацетальдегіду та альдегіддегідрогенази, на ефективність біоконверсії етанолу в оцтовий альдегід інтактними клітинами мутантних штамів H. polymorpha. Не сприяє підвищенню ефективності біоконверсії використання мутантів з відсутніми активностями формальдегіддегідрогенази та каталази. Алкогольдегідрогеназа (на відміну від алкогольоксидази) не забезпечувала ефективну біотрансформацію етанолу в оцтовий альдегід. Найвища ефективність процесу спостерігалася при використанні клітин мутанта H. polymorpha 33-7 з пошкодженою глюкозною катаболітною репресією синтезу ферментів метаболізму метанолу, конститутивним синтезом алкогольоксидази під час утилізації глюкози і підвищеною активністю фермента.

2. Розроблено новий метод отримання мутантів з підвищеною активністю алкогольоксидази, який полягає у використанні азиду натрію (як інактиватора фермента в результаті стехіометричного зв’язування з ФАД) у реакційній суміші для якісного визначення активності алкогольоксидази в колоніях дріжджів. Отримано мутант 7-4А з активністю алкогольоксидази до 6,8 Од/мг білка (підвищеною у 3,3 рази, порівняно з вихідним штамом 33) після культивування клітин у середовищі з глюкозою. Підібрано умови для отримання високого виходу біомаси штаму 7-4А.

3. Оптимізовано умови проведення біоконверсії етанолу в оцтовий альдегід клітинами (15 г/л) штаму 7-4А. Встановлено доцільність використання 1 М тріс-HCl буферу, рН 8,0, у інкубаційній суміші для біотрансформації з метою забезпечення ефективного окислення клітинами 0,217 М (1%) етилового спирту. Стимуляція ефективності конверсії спостерігалася при зниженні температури до 3^о С.

4. Клітини штаму 7-4А можуть бути успішно використані у циклічних процесах біотрансформації та для конверсії етанолу в ацетальдегід безпосередньо зі спиртової бражки.

5. Показано, що мутації, які приводять до порушення індукованої етанолом деградативної інактивації алкогольоксидази, підвищують ефективність біоконверсії етанолу в ацетальдегід клітинами мутантів P. methanolica з генетичними блоками ацетил-КоА синтетази та ізоцитратліази.

6. У присутності інгібітора вакуолярних протеїназ – фенілметилсульфонілфториду, пермеабілізовані дигітоніном клітини мутанта 7-4A із пошкодженням або сповільненням етанольної інактивації алкогольоксидази в процесі макропексофагії, спричиненим використанням цих хімічних реагентів, при 30^о С конвертували 96,4% екзогенного етанолу в ацетальдегід.

Публікації автора:

1. Мороз О.М., Кшеминская Г.П., Сибирный А.А. Биотрансформация этанола в уксусный альдегид диким и мутантными штаммами метилотрофных дрожжей Hansenula polymorpha // Микробиология. - 1994. - Т.63,№6. - С. 1050-1057.

2. Сибирный А.А., Кулачковский А.Р., Мороз О.М. Образование гибридных микротелец, глиокcипероксисом, содержащих алкогольоксидазу и малатсинтазу, у регуляторного мутанта метилотрофных дрожжей Pichia methanolica // Микробиология. - 1996. - Т. 65, №4. - С. 457-461.

3. Kulachkovsky A.R., Moroz O.M., Sibirny A.A. Impairment of peroxisome degradation in the mutants of methylotrophic yeast Pichia methanolica defective in acetyl-CoA synthetase and isocitrate lyase // Yeast. - 1997. - V. 13. - P. 1043-1052.

4. Kulachkovsky A.R., Stasyk O.V., Ksheminska H.P., Fayura L.R., Moroz O.M., Sibirny A.A. Nutrition and ultrastructure of the mutants of methylotrophic yeast defective in biogenesis and degradation of peroxisomes // Food Technol. Biotechnol. - 1998. - V. 36, №1. - P. 19-26.

5. Gonchar M.V., Maidan M.M., Moroz O.M., Woodward J.R., Sibirny A.A. Microbial O₂- and H₂O₂-electrode sensors for alcohol assays based on the use of permeabilized mutant yeast cells as the sensitive bioelements // Biosensors & Bioelectronics. - 1998. - V. 13. - P. 945-952.

6. Moroz O.M., Gonchar M.V., Sibirny A.A. Efficient bioconversion of ethanol to acetaldehyde using a novel mutant strain of the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha // Biotechnol. Bioeng. - 2000. – V. 68. – P. 44-51.

7. Sibirny A.A., Moroz O.M., Ksheminska G.P. The mutants of methylotrophic yeasts as a biocatalysts for ethanol transformation into acetaldehyde // Proc. of the 16-th International Conference on Yeasts. Genetics and Molecular Biology. - Vienna (Austria). - 1992. - S615. - P14. – Р. 53B.

8. Sibirny A.A., Gonchar M.V., Kashchenko V.E., Ksheminska G.P., Vytvytska O.P., Moroz O.M., Stasyk O.V. The mutants of methylotrophic yeasts and their biotechnological applications // Proc. of the International Workshop on Genetics and Molecular Biology of Nonconventional Yeasts. -Basel. - 1992. - P. 57.

9. Sibirny A.A., Gonchar M.V., Kashchenko V.E., Ksheminska G.P., Vytvytska O.P., Moroz O.M. New mutants of methylotrophic yeasts and their biotechnological applications // Proc. of the 8-th International Symposium on Yeasts. - Atlanta, Georgia (USA). - 1992. - P. 64-65.

10. Мороз О.М. Порівняльна характеристика біоконверсії етанолу в оцтовий альдегід дикими і мутантними штамами метилотрофних дріжджів // Тези доп. І Установчого (VIII) з’їзду Українського мікробіологічного товариства. - Одеса, 1993. - Мікробіол. журн. - 1994. - Т. 56,№1. - С. 84.

11. Sibirny A.A., Moroz O.M., Ksheminska G.P. Ethanol bioconversion into acetaldehyde by mutant strains of methylotrophic yeasts Hansenula polymorpha // Proc. of the 7-th International Symposium on the Genetics of Industrial Microorganisms. - Montreal (Canada). - 1994. - P77. - P. 122.

12. Moroz O.M., Sibirny A.A. Acetaldehyde production by mutants of methylotrophic yeast Hansenula polymorpha // Proc. of the 7-th Europ. Congress on Biotechnology. - Nice (France). - 1995. - V. 2. - P. 85.

13. Stasyk O.V., Moroz O.M., Kulachkovsky A.R., Stasyk O.G., Cregg J.M., Sibirny A.A. Hansenula polymorpha mutants which efficiently express alcohol oxidase promoter-directed own and foreign proteins in glucose medium // Proc. of the 1-st Hansenula polymorpha Worldwide Network (HPWN) Conference. – Dusseldorf (Germany). – 2000.

14. Stasyk O.V., Moroz O.M., Maidan M.M., Stasyk O.G., Kulachkovsky A.R., Gonchar M.V., Cregg J.M., Sibirny A.A. Mutants of the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha deficient in glucose repression as hosts for production of alcohol oxidase and heterologous proteins // Proc. of the Tenth International Symposium on Yeasts. – Arnhem (The Netherlands). – 2000. – P. 159.

15. Nazarko T.Y., Moroz O.M., Rusyn I.B., Stasyk O.V., Kulachkovsky A.R., Gudz S.P., Sibirny A.A. Regulation of peroxisome homeostasis in methanol- and alkane-utilizing yeasts. INTAS 99-00788 // Proc. of the 3-rd INTAS Interdisciplinary Symposium on General Biochemistry, Biotechnology and Environment (Grant Monitoring Conference). – Moscow (Russian). – 2000. – P. 62-63.

16. Nazarko V., Pochapinskyi O., Nazarko T., Moroz O., Stasyk O., Kulachkovsky A., Veenhuis M., Sibirny A. Peroxisome homeostasis in the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha // Proc. of the 21-st International Specialized Symposium on Yeasts (ISSY 2001) “Biochemistry, Genetics, Biotechnology and Ecology of Non-conventional Yeasts (NCY)”. – Lviv (Ukraine). – 21-25 August, 2001. – P. 142.