Анотація до роботи:

Єрмак Є.Л. Конкурентне зв'язування біологічно активних речовин з полінуклеотидними матрицями. - Рукопис.

Дисертація на одержання наукового ступеню кандидата фізико-математичних наук за спеціальністю 03.00.02 - біофізика. - Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна, м. Харків, 2008.

Дисертація присвячена розробці методик аналізу конкурентної взаємодії біологічно активних речовин з молекулами нуклеїнових кислот у випадку мультимодального зв'язування одної з БАР. Робота виконана за допомогою комплексу сучасних фізичних методів (абсорбційна спектрофотометрія у видимій і УФ областях, чисельні методи розрахунку параметрів зв'язування в системах БАР₁ - НК - БАР₂). Розроблено нову методику аналізу спектрів поглинання для систем БАР₁ - поліелектроліт - БАР₂ для випадку, коли один з лігандів не поглинає у видимій області спектра, а другий використовується як забарвлена мітка, що поглинає у видимій області спектра. Проаналізовано різні моделі зв'язування в розглянутих системах, визначено оптимальні моделі, термодинамічні і стехіометричні параметри зв'язування біологічно активних речовин з полімерними матрицями. Показано, що теофілін, кофеїн, цитидин і його біологічно активні аналоги утворюють на ДНК один тип комплексів і не інтеркалюють у ДНК. Також показано, що вони зменшують кількість агрегованого на НК ліганду-мітки.

Розроблено методику аналізу спектрів поглинання для систем БАР₁ - НК - БАР₂ у випадку, коли оба ліганда поглинають у близьких областях спектру. Аналіз проводився на прикладі систем ActІІ - ДНК - бромистий етидій ActІІ - ДНК - Хоест 33258. Показано, що в присутності бромистого етидію зменшується кількість інтеркальованого в ДНК ActІІ, а в присутності Хоеста 33258 - мономерно зв'язаного в боріздці.

1. У ході виконання роботи було вивчено фізичні механізми конкурентного зв'язування різних комбінацій біологічно активних речовин з НК. Для цього була розроблена нова методика аналізу спектрів поглинання в потрійних системах БАР₁ – НК – БАР₂. Показано ефективність даної методики незалежно від області поглинання лігандів. Розроблена методика аналізу конкурентного зв'язування може бути використана для одержання параметрів комплексоутворення з нуклеїновими кислотами БАР, що не поглинають ні у видимій, ні в УФ областях спектру; для визначення типу зв'язування БАР з поліелектролітною матрицею; для врахунку впливу одної з конкуруючих БАР на зв'язування другої з нуклеїновою кислотою та ефектів сінергизму. Показано, що розроблений нами підхід є ефективним у випадку, коли конкуруючі БАР зв'язуються з ДНК різними способами та у випадку мультимодального зв'язування одної з БАР. Отримані у роботі дані можуть бути використані для аналіз взаємодії біологічно активних речовин з нуклеїновими кислотами та дослідження впливу конкуруючих речовин на біологічну активність препаратів ген-спрямованої дії.

2. Показано, що БАР, що мають слабку спорідненість до НК (наприклад, теофілін і кофеїн) впливають на зв'язування інших лігандів з НК тільки при великих концентраціях БАР. При цьому їхній вплив виявляється як за рахунок взаємодії БАР у розчині так і за рахунок безпосередньої конкуренції за місця зв'язування з НК. Показано, що теофілін є більш активним, чим кофеїн, акцептором ароматичних молекул у розчині, у той час, як константи зв'язування цих двох БАР з ДНК практично збігаються.

3. Визначено, що в деяких системах вплив конкуруючих БАВ зводиться в основному до конкуренції за місця зв'язування на НК і практично відсутня взаємодія БАР у розчині. Також показано, що конкуруюча дія може виявлятися навіть у випадку, коли механізми взаємодії БАР з НК різні. Аналіз таких взаємодій проведений на прикладі ряду систем біологічно активний нуклеозид – ДНК – бромистий етидій. Отримано константи зв'язування з ДНК біологічно активних нуклеозидів, азо-похідних цитидину. Показано, що ці БАР взаємодіють з ДНК у жолобі і не мають АТ- чи ГЦ-специфічністі зв'язування. Показано, що на відміну від теофіліну і кофеїну конкурентна дія нуклеозидів виявляється при їх концентраціях, приблизно рівних концентрації в суміші бромистого етидія.

4. Показано, що структура і конформація матриці нуклеїнової кислоти відіграє істотну роль при взаємодії з нею БАР. Наприклад, показано, що актиноциновое похідне ActІІ зв'язується з одно- та двоспіральною полірибоцитидиловою кислотою тільки в жолобі з утворенням мономерно зв'язаних і агрегованих комплексів. З ДНК ж ActІІ додатково утворює комплекс по типу інтеркаляції. Також показано, що кофеїн зв'язується з односпіральною poly(C) і практично не взаємодіє з двуспіральною.

5. Вперше отримано, що при зв'язуванні 6-азацитозіну рибофуранозіду з ДНК у присутності бромистого етидія константа утворення комплексу 6-азацитозіну рибофуранозіду з ДНК значно вище, ніж при його взаємодії з ДНК під час відсутності етидіуму броміду, тобто спостерігається ефект сінергізму (збільшення активності БАР у суміші).

6. На прикладі модельних систем ActІІ – ДНК – бромистий етидій і ActІІ – ДНК – Хоехст 33258 розроблена методика аналізу спектрів складних потрійних систем, у яких обоє БАР поглинають в одній чи близьких областях спектру. Розраховано параметри зв'язування ActІІ з тимусною ДНК у присутності конкуруючих БАР різного типу (інтеркалятора бромистого етидія і Хоехста 33258, що зв'язується в малому жолобі ДНК). Показано, що ActІІ зв'язується з тимусною ДНК мультимодально і за допомогою конкуруючих БАР можна змінювати співвідношення різних типів комплексів ActІІ з ДНК і в такий спосіб впливати на його активність.

Публікації автора:

1. Круглова Е.Б., Ермак Е.Л. Исследование конкурентного связывания двух лигандов: актиноцинового антибиотика и кофеина с ДНК // Вестник Харьковского университета. Биофизический вестник. – 2003. – Вып.1(12) – С.64 – 69.

2. Круглова Е.Б., Ермак Е.Л. Конкурентное связывание двух лигандов: актиноцинового производного и кофеина с полирибоцитидиловой кислотой в разных конформационных состояниях // Вестник Харьковского университета. Биофизический вестник. – 2004. – Вып.1-2(14) – С.32-37.

3. Ермак Е.Л., Круглова Е.Б. Влияние конкурирующих лигандов разного типа на связывание актиноцинового производного ActII с ДНК // «Вестник СевГТУ» (Физика и математика). – 2005. – т.70. – С. 118 - 126.

4. Ермак Е.Л., Круглова Е.Б. Связывание теофиллина с тимусной ДНК в присутствии конкурирующих лигандов // Биофизический вестник. – 2007. – Вып.2 (19). – С. 13 - 19.

5. Iermak Ie.L., Kruglova O.B., Palchykovska L.H., Alexeeva I.V. Spectrophotometrical study of mechanisms of binding of cytidine analogues and ethidium bromide with DNA // Вiopolymers and cell. - 2007. - V. 23. - № 6. - Р. 529 - 536.

6. Ermak E.L., Kruglova E.B. Spectrophotometric investigation of competitive binding of two ligands: actinocin antibiotic and caffeine to DNA // Proc. of the XVI International School-Seminar Spectroscopy of Molecules and Crystals XVI ISSSMC. – Sevastopol, Ukraine. – 2003. – P.295.

7. Ermak E.L., Kruglova E.B. Thermodynamic characteristics of interaction in three-component systems: DNA-ligand-caffeine in aqueous solutions // Abstr. Of The 2^nd International Conf. Physics of Liquid Matter: Modern Problems PLM MP. – Kyiv, Ukraine. – 2003. – P.171.

8. Ermak E.L., Kruglova E.B., Maleev V. Ya. Investigation of competitive binding of biologically active ligands to nucleic acids // Тези 1 Української наукової конференції Проблеми біологічної і медичної фізики ПБМФ – 2004. – Харків, Україна. – 2004. – С. 54.

9. Ermak E.L., Kruglova E.B. Investigation of competitive binding of biologically active ligands with calf thymus DNA in aqueous solution // 3^rd International Conference Physics of Liquid Matter: Modern Problems PLM MP. – Kyiv, Ukraine. – 2005. – P.191.

10. Ермак Е.Л., Круглова Е.Б. Связывание актиноцинового производного ActII с ДНК в присутствии бромистого этидиума и Хоехста 33258 // Материалы Всеукраинской научно-технической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых Актуальные вопросы теоретической и прикладной физики и биофизики “Физика. Биофизика – 2005”.Севастополь, Украина. – 2005. – С. 62.

11. Ermak E.L., Kruglova E.B. Binding of the new actinicine derivative ActII to calf thymus DNA in the presence of competing ligands // Proceedings of the 8^th Romanian Biophysics Conference with international participation "Advanced Biomaterials and Biophysical Techniques. Iasi, Romania. – 2005. – P.126-127.

12. Ermak E.L., Kruglova E.B. New aspects of ethidium bromide interaction with calf thymus DNA // П’ята Харківська конференція молодих науковців. Радіофізика та НВЧ електроніка. – Харків, Україна. – 2005. – С.103.

13. Iermak Ie.L., Kruglova O.B., Bolbukh T.V. Binding modes of ethidium bromide to calf thymus DNA // Proceedings of the Workshop on the Structure and Function of Biomolecules II 2006. Bedlewo, Poland – 2006. – P. 68.

14. Iermak Ie.L., Kruglova O.B. Study of actinocine derivative and ethidium bromide competitive binding to calf thymus DNA // VII Kharkiv Young Scientist Conference on “Radiophysics and Electronics”. – Kharkiv, Ukraine. – 2007. – P.39.

15. Ермак Е.Л., Круглова Е.Б. Сравнительный анализ взаимодействия взаимодействия теофиллина и кофеина с тимусной ДНК в присутствии конкурирующих лигандов // IV Всеукраинская научно-техническая конференция Актуальные вопросы теоретической и прикладной биофизики, физики и химии “БФФХ – 2008”. Севастополь, Украина. – 2008. – С.152 – 153.

16. Ермак Е.Л., Круглова Е.Б. Методика анализа конкурентного связывания двух лигандов с нуклеиновыми кислотами // 1-а Всеукраїнська наукова конференція молодих вчених Фізика низьких температур КМВ-ФНТ-2008. – Харків, Україна. – 2008. – С.102.

17. Iermak Ie.L., Kruglova O.B. Study of ethidium bromide binding to calf thymus DNA in presence of competing ligands in aqueous solution // 4^th International Conference Physics of Liquid Matter: Modern Problems PLM MP. – Kyiv, Ukraine. – 2008. – P.206.