Василовська Світлана Володимирівна. Функціональна характеристика клітин-попередників кордової крові в умовах культивування in vitro : Дис... канд. наук: 03.00.11 - 2008.
Анотація до роботи:
Василовська С.В. Функціональна характеристика клітин-попередників кордової крові в умовах культивування in vitro. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.11 – цитологія, клітинна біологія, гістологія. – Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2008.
Дисертація присвячена дослідженню впливу різних умов культивування на функціональну активність гемопоетичних клітин-попередників кордової крові (ГКП КК), та визначенню оптимальних умов довготривалої підтримки кровотворення in vitro.
Показано, що підтримка кровотворної активності ГКП КК у довготривалій культурі можлива з використанням у якості фідерного шару мітотично інактивованих клітин строми фетальної печінки (ФП) 7-8 тижнів гестації і фетальної кістки (ФК) 10-11 тижнів гестації. Максимальні значення показників кількості та клоногенної активності ГКП отримано на 3-му тижні культивування. Встановлено, що фідерний шар ФП більш ефективний у підтриманні гемопоезу in vitro, ніж фідер ФК. Додавання в культуральну систему, що містить фідерний шар ФП, комплексу екзогенних цитокінів (GM-CSF, IL-3, SCF, IL-6) стабілізувало позитивну динаміку зростання як чисельності ядровмісних клітин, так і клоногенних попередників (КУО-ГМ) протягом 5 тижнів дослідження і призводило до 80-разового збільшення загальної кількості клоногенних ГКП у порівнянні з їх вмістом у вихідній суспензії.
Найбільш виражений стимулюючий ефект фактора росту Flt-3 визначено після 16-годинної інкубації з ним клітин фракції АС133+. Подальше довготривале культивування АС133+ на фідерному шарі зі строми фетальної печінки з цитокінами призводило до збільшення в 55 разів кількості ядровмісних клітин у суспензії, а також зростання відсотка клоногенних попередників з 4,2% – у вихідній фракції до 35,1% на 5-му тижні культивування.
У дисертаційній роботі наведено теоретичне узагальнення і нове вирішення актуальної наукової проблеми щодо підтримки кровотворення в довготривалій культурі. На основі дослідження клоногенних властивостей гемопоетичних клітин-попередників кордової крові in vitro визначено комплекс умов, що сприяли збільшенню кількості клітин та їх функціональної активності.
Порівняльний аналіз методів виділення фракції мононуклеарів кордової крові довів ефективність використання одноразового центрифугування у градієнті щільності Hystopaque (1,077 г/мл) для отримання фракції, збагаченої клоногенними клітинами-попередниками, у той час, як використання градієнта Ficoll-Hypaque низької щільності (1,065 г/мл) дозволило збагатити фракцію клоногенними попередниками на тлі значної втрати загальної кількості ядровмісних клітин.
Показано, що фідерні шари, утворені мітотично інактивованими клітинами строми фетальної печінки (7-8 тижнів гестації) та фетальної кісткової тканини (10-11 тижнів гестації), здатні до підтримки кровотворення у довготривалій культурі, що зумовлено зростанням кількості та клоногенної активності гемопоетичних клітин впродовж 3 тижнів культивування. Доведено, що фідерний шар зі строми фетальної печінки більш ефективний у підтриманні гемопоезу in vitro, при культивуванні на якому досягнуто 9-разове збільшення кількості ядровмісних клітин та зростання у 19 разів кількості клоногенних попередників у суспензії.
Застосування комплексу цитокінів (SCF, IL-3, IL-6, GM-CSF) у поєднанні з фідерним шаром зі строми фетальної печінки призводило до зростання загальної кількості ядровмісних клітин впродовж всього терміну культивування з максимальним їх збільшенням на 5-му тижні. Виявлено 80-разове збільшення кількості клоногенних клітин-попередників у порівнянні з їх вмістом у вихідній суспензії.
Визначено низький клоногенний потенціал клітин фракції АС133+ кордової крові, зумовлений обмеженою здатністю до колонієутворення в агарі під впливом GM-CSF. 4,2 % клітин ізольованої фракції АС133+ були клоногенними.
Інкубація АС133+ клітин з фактором росту Flt-3 протягом 12-18 годин призводила до зростання кількості клоногенних попередників. Найбільш виражений стимулюючий ефект Flt-3 був визначений після 16 годин інкубації, що дозволило збільшити вміст клоногенних попередників у фракції АС133+ клітин до 23,4%.
При довготривалому культивуванні АС133+ клітин кордової крові на фідерному шарі зі строми фетальної печінки та комплексу цитокінів (SCF, IL-3, IL-6, GM-CSF), а також застосуванні попередньої 16-годиної інкубації з фактором росту Flt-3 досягнуто збільшення кількості ядровмісних клітин в 55 разів. Цей комплекс умов сприяв зростанню відсотка клоногенних попередників у фракції АС133+ клітин з 4,2% – у вихідній фракції до 35,1% – на 5-му тижні культивування.
З використанням оригінальної системи культивування гемопоетичних клітин у порожнині дифузійної камери продемонстровано, що регуляція гемопоетичної активності зі сторони стромального матриксу в культурі in vitro носить дистантний характер і здійснюється гуморальними факторами, продукованими клітинами фідерного шару за відсутності безпосереднього контакту з кровотворними клітинами-попередниками.
Публікації автора:
Білько Н.М., Дорошенко О.Я., Василовська С.В., Вотякова І.А., Білько Д.І. Оцінка проліферативного потенціалу кровотворних стовбурових клітин, отриманих з онтогенетично різних джерел // Трансплантологія. – 2003. – Т. 4. –№ 1. – С. 58-59.
(Особисто дисертант провела дослідження проліферативного потенціалу клітин кордової крові, їх аналіз та узагальнення, брала участь у написанні статті).
Василовская С.В., Вотякова И.А., Лукаш Л.Л., Мацука Г.Х. Получение и характеристика клеток ранних этапов гемопоэза человека с использованием методов культивирования in vitro // Биополимеры и клетка. – 2002. – Т. 6. – № 18. – С. 534-539.
(Особисто дисертант провела експериментальні дослідження, їх аналіз та узагальнення, брала участь у написанні статті).
Білько Н.М., Вотякова І.А., Василовська С.В., Білько Д.І. Роль стромального матриксу в підтримці довготривалого гемопоезу в культурі тканин in vitro // Трансплантологія. – 2004. – Т. 5. – № 1. – С. 39-43.
(Особисто дисертант провела культивування гемопоетичних клітин на стромальному матриксі, проаналізувала результати, брала участь у формулюванні висновків та написанні статті).
І.А. Вотякова, Н.М. Білько, С.В. Василовська, О.Я. Дорошенко, Д.І. Білько, Н.А. Кудря, В.М. Іванов. Кордова кров, перспектива її вивчення та використання як джерела стовбурових клітин // Трансплантологія. – 2004. – Т. 7. – № 3. – С. 103-107.
(Особисто дисертант брала участь у підборі та аналізі літературних даних, написанні статті).
Василовська С.В., Білько Н.М. Вплив фактора росту Flt-3 на функціональну активність АС133+ клітин кордової крові в культурі in vitro // Наукові записки НаУКМА. – 2007. – Т. 67. – С. 19-23.
(Особисто дисертант провела дослідження впливу інкубації АС133+ клітин кордової крові з фактором росту Flt-3, клоногенний аналіз у агарі, проаналізувала результати, брала участь у статистичній обробці та формулюванні висновків).
Bilko N.M., Votyakova I.A., Vasylovska S.V., Bilko D.I. Characterization of the interaction between stromal and haematopoietic progenitor cells in expansion cell culture models // Cell Biol. Int. – 2005. – V. 29. – № 1. – P. 83-86.
(Особисто дисертант отримала фідерні шари зі строми кровотворних органів, провела культивування гемопоетичних клітин та клоногенний аналіз у агарі, проаналізувала результати, брала участь у формулюванні висновків).
Патент України № 16917U, МПК С12N 5/00, C12N 5/08. Спосіб культивування клітин кордової крові / Білько Н.М, Василовська С.В., Білько Д.І., Вотякова І.А., Бойко Р.В. Заявл. 3.07.2006; Опубл. 15.08.06. – Бюлетень «Промислова власність». – 2006. – № 8. – C. 18.
(Особисто дисертант провела експериментальні дослідження по культивуванню гемопоетичних клітин-попередників кордової крові, брала участь у аналізі результатів та формулюванні висновків).
Василовська С.В. Оцінка функціональної активності стовбурових клітин ембріональних тканин в культурі in vitro // Тези доповідей VI-ї конференції молодих онкологів України «Сучасні проблеми експериментальної та клінічної онкології». – Київ. – 2003. – С. 11.
(Особисто дисертант провела дослідження функціональної активності клітин, аналіз результатів).
N.Bilko, I.Votyakova, S.Vasylovska, D.Bilko, O.Doroshenko, O.Barash. Characteristics of interaction between stromal and hematopoietic progenitor cells in cell culture in vitro // Збірник тез I Установчого з’їзду Українського товариства клітинної біології. – Львів. – 2004. – С. 255.
(Особисто дисертант провела культивування гемопоетичних клітин на стромальному матриксі, проаналізувала результати, брала участь у формулюванні висновків).
Билько Н.М., Вотякова И.А., Василовская С.В., Билько Д.И. Характер взаимодействия стромального матрикса и АС133+ клеток кордовой крови в трехмерной культуре in vitro // Материалы международного симпозиума по биологии клетки в культуре «Стволовые клетки, регенерация, клеточная терапия». Цитология. – 2004. – Т. 46. – С. 897-898.
(Особисто дисертант провела експериментальні дослідження по культивуванню гемопоетичних клітин-попередників та їх аналіз).
Василовския С.В., Билько Д.І., Билько Н.М. Изучение гемопоэза в длительной культуре с фидером из клеток фетальной печени разныхсроков гестации // Труды Международного междисциплинарного симпозиума «От экспериментальной биологии к превентивной и интегративной медицины». – Судак. – 2005. – С. 30-31.
(Особисто дисертант провела експериментальні дослідження, їх аналіз та узагальнення).
Василовська С.В., Білько Н.М. Вивчення проліферації і диференціювання клітин-попередників з кордової крові у культурі клітин in vitro // Збірник тез ІІІ Міжнародної наукової конференції студентів та аспірантів «Молодь та поступ біології». – Львів. – 2007. – С. 391-392.
(Особисто дисертант провела експериментальні дослідження, їх аналіз та узагальнення).
Василовська С.В., Білько Н.М.. Роль строми у підтриманні гемопоетичної активності клітин-попередників кордової крові в культуральній системі in vitro з використанням дифузійних камер // Тези VIІІ конференції молодих онкологів з міжнародною участю «Сучасні проблеми експериментальної і клінічної онкології». – Київ. – 2007. – С. 12.
(Особисто дисертант отримала фідерні шари зі строми кровотворних органів, провела культивування гемопоетичних клітин та клоногенный аналіз у агарі, проаналізувала результати, брала участь у формулюванні висновків).
Bilko N.M., Vasilovskaja S.V. Investigation of clonogenic activity of hematopoietic progenitor cells of the cord blood under the influence of fetal stromal feeder layers in long-term in vitro culture// Proceedings of International Interdisciplinary Symposium «From experimental biology to preventive and integrative medicine». – Sudak. – 2007. – P. 17-18.
(Особисто дисертантом проведено експериментальні дослідження, їх аналіз та узагальнення).
